SMLM с временным разрешением (с большим сдвигом PAR) позволил визуализировать формирование и миграцию динамического кластера HA в живой клетке.

Jul 23, 2023

Том 13 научных докладов, номер статьи: 12561 (2023) Цитировать эту статью

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Свойства мерцания отдельной молекулы имеют решающее значение для микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM). Обычно методы SMLM включают регистрацию нескольких кадров дифракционно-ограниченных ярких пятен одиночных молекул со временем экспозиции детектора, близким к периоду мигания. Это устанавливает ограничение на временное разрешение SMLM до нескольких десятков миллисекунд. Понимая, что значительная часть одиночных молекул излучает фотоны в течение временных масштабов, намного меньших, чем средний период мигания, мы предлагаем ускорить сбор данных для захвата этих быстрых излучателей. Здесь мы предлагаем метод SMLM (shortSMLM) на основе короткого воздействия, основанный на детекторе sCMOS, для понимания динамических событий (как на уровне отдельной молекулы, так и на уровне ансамбля). Этот метод продемонстрирован на модели заболевания гриппом-А, где клетки NIH3T3 (как фиксированные, так и живые клетки) были трансфицированы плазмидной ДНК Dendra2-HA. Анализ показывает улучшение временного разрешения в 2,76 раза, при этом приходится жертвовать пространственным разрешением, а смещение PAR-сдвига разрешения частиц (с точки зрения точности локализации) составляет \(\sim\) 11,82 нм по сравнению со стандартным SMLM. Мы визуализировали динамическое образование кластеров HA в трансфицированных клетках через 24 часа после трансфекции ДНК. Отмечено, что снижение пространственного разрешения существенно не меняет характеристики кластера (плотность кластера, \(\#\) молекул/кластер, разброс кластера и т.д.) и действительно сохраняет критические особенности. Более того, покадровая визуализация показывает динамическое образование и миграцию кластеров гемагглютинина (НА) в живой клетке. Это говорит о том, что \(короткий SMLM\) использование синхронизированного sCMOS-детектора с высоким QE (работающего при коротком времени экспозиции) отлично подходит для изучения временной динамики в клеточной системе.

Стандартные методы микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM) (fPALM1, STORM2, PALM3, IML-SPIM4, MINFLUX5,6, dSTORM7, SOFI8, ROSE9, SMILE10,11, POSSIBLE12 и варианты13,14,15,16,17) обычно позволяют получить несколько тысяч (\(> 10^{3}\)) изображений одиночных молекул для восстановления одного изображения со сверхразрешением. Это требует значительного времени сбора данных, чем обычное время экспозиции камеры и считывания. Чтобы ускорить общее временное разрешение, необходимо ускорить сбор данных. Однако существует ограничение на временное разрешение из-за времени цикла флуоресценции молекулы18. В последнее время было проведено мало исследований с использованием быстро мигающих молекул, высокой интенсивности возбуждения, темных состояний и sCMOS-камеры19,20,21,22,23. В других исследованиях было показано многообещающее сокращение времени сбора данных с использованием вычислительных методов. Другие методы, включающие использование быстрых вычислительных механизмов (FPGA-GPU и CUDA) в сочетании с искусственным интеллектом, показали большой потенциал в SMLM24,25,26,27. Хотя эти методы полезны, они склонны к фотообесцвечиванию. Здесь мы обсуждаем быстрый сбор данных с помощью передовой технологии sCMOS для захвата быстромигающих флуоресцентных белков (Dendra2). Поведение мигания Dendra2 вместе со временем включения/выключения подробно изучено Авиловым и др.28. Ожидается, что методы быстрого сбора данных вместе с быстрыми вычислительными механизмами представляют собой мощную комбинацию и, скорее всего, позволят обеспечить получение изображений со сверхвысоким разрешением в реальном времени.

За последние несколько лет в этом направлении произошел значительный прогресс, и многие исследовательские группы занялись этим вопросом. Отличным подходом является увеличение количества активных одиночных молекул на кадр без изменения интенсивности и других экспериментальных параметров21,29. Однако этот метод имеет свою цену, поскольку большая активация может привести к перекрытию дифракционно-ограниченных сигнатур отдельных молекул, что приведет к неотличимости отдельных молекул и впоследствии увеличит сложность30. Недавняя работа Лина и др. количественно сравнили качество изображения микротрубочек, иммуномеченных с использованием красителя Alexa Fluor 64719. Другое исследование Diekmann et al. показали, что два критических фактора (т.е. точность локализации и эффективность маркировки) определяют качество изображения SMLM. Они систематически исследовали влияние скорости на качество изображения для различных красителей (AF647, CF680, CF660C, Dy634) при различной эффективности и интенсивности мечения21. Насколько нам известно, фотопереключаемые белки, такие как Dendra 2, никогда не использовались для быстрой визуализации и покадровой локализационной микроскопии и, следовательно, представляют собой важный класс зондов, используемых в микроскопии сверхвысокого разрешения. В частности, фотопереключаемые белки позволяют клонировать/конъюгировать с интересующим белком, что делает их пригодными для изучения биологических процессов (таких как прогрессирование заболевания31,32,33) и помогает понять основной механизм.